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細胞培養的具體操作步驟分析
點擊次數:35 發布時間:2021-05-10

細胞培養這個生物學研究蕞基礎的技術之一,已經滲透進了科研工作的方方麵麵。本文將與大家分享細胞培養經驗的總結,涵蓋了昆蟲細胞蛋白表達常用到的sf9細胞與哺乳動物細胞蛋白表達係統的CHO細胞與HEK293細胞,主要介紹了細胞複蘇、細胞傳代、細胞凍存的具體操作方法。

 

 

細胞複蘇:
1、細胞培養條件
2、複蘇流程:
(1)確認水浴鍋的水清潔可用,方可提前打開37度預熱。
(2)確認好複蘇細胞的液氮罐中具體位置,並做好複蘇登記。
(3)提前做好複蘇準備,預熱培養基。
(4)懸浮和貼壁細胞複蘇參數:
(5)將細胞快速放入37度水浴鍋中迅速溶解,1.8 ml時間大概1分30秒,1 ml大概1 min左右,需計時,期間不要老是拿起來觀察,需要快速複溶,避免細胞受到損傷。
(6) 貼壁細胞需離心, 1000 rpm,5 min;懸浮細胞直接加入預熱的培養基中然後放入培養箱中
(7)貼壁細胞離心後去除上清,用預熱的培養基重懸細胞後加入到T25方瓶,蕞後放入培養箱中培養。
(8)取小樣計數觀察,細胞活力在70%以上算正常。低於70%活力可能細胞狀態不太好,需要培養和恢複。

細胞傳代培養
1. 懸浮細胞傳代流程:
(1) 先將裝有細胞的搖瓶從培養箱拿出,用酒精噴灑瓶身後將搖瓶拿進超淨台;
(2) 打開搖瓶瓶蓋,用200 ul移液器取100~200 ul細胞放入1.5 mlEP管中,瓶蓋過火,擰緊,將培養瓶放回搖床;
(3)將200 ul細胞混勻,取10 ul細胞加入10 ul台盼藍,顯微鏡下計數。根據細胞數決定下遊實驗;
(4)細胞需計數兩次求平均值;
(5)懸浮細胞生長參數
(6)根據不同細胞的生長曲線在合適的時間和密度給細胞接種傳代;

以sf9細胞為例:
細胞接種密度0.4 x10^6個/ml,24 h密度1x10^6個/ml,48 h密度2.4x10^6個/ml,72 h密度6x10^6個/ml,此時需要傳代細胞;要求留樣100 ml0.4 x10^6個/ml具體操作如下:
計算:需要母細胞體積=100*0.4/6=6.6ml
需要培養基體積=100-6.6=93.4ml
將上麵體積的細胞和培養基加入到搖瓶中,放回27度培養箱培養即可

2. 貼壁細胞傳代流程:
(1) 顯微鏡下觀察細胞狀態和密度,80%匯合率以上需要傳代;
(2) T25方瓶中加入0.5 ml~1 ml 0.25%胰酶溶液(需37度預熱),使瓶底細胞都浸入溶液中。放入37度培養箱進行消化;
(3) 不同細胞消化時間不一樣,初次培養貼壁細胞消化時間可以定在1min,顯微鏡下觀察消化結果,消化不完全可以再適度加長消化時間;
(4)對於有經驗的細胞消化可以定個準確的時間,消化結束後將培養皿放入顯微鏡下觀察細胞,隨著時間變長,原先貼壁細胞逐漸變圓,慢慢脫落,在還未飄起時棄掉胰酶,加入含有10%FBS的新鮮培養基終止消化;
(5) 用1 ml移液器輕輕吹打細胞,將細胞全部吹下後,可進行傳代,一般是1:3傳代;
(6) 貼壁不牢的細胞可以用0.1%的凝膠包被4℃ 30min,用PBS清洗5次。

細胞凍存
1、細胞凍存參數

2、貼壁細胞凍存流程:
(1)將胰酶、培養基提前37度預熱;凍存液提前配好放到4度冰箱預冷;
(2)先將裝有細胞的方瓶從培養箱拿出,用酒精噴灑瓶身後將搖瓶拿進超淨台;
(3) 打開方瓶瓶蓋,將方瓶中的培養基倒幹淨;
(4) 根據細胞消化難易程度添加適量的胰酶;T25方瓶加1 ml胰酶,T75方瓶加2ml胰酶;
(5) 根據細胞消化難易程度放入37度培養箱消化1-5 min,知道看見大片的細胞開始脫落,要及時終止消化;
(6) 終止培養基需要含有至少10%血清,通常終止比例為1:10(1ml胰酶需要加入10 ml終止培養基),對胰酶比較敏感的細胞需要終止後離心後換新鮮的培養基;
(7) 終止後將細胞輕輕吹打混勻,避免結團,細胞收集到15 ml或者50 ml離心管中,將離心管配平,放入離心機中1000 rmp5分鍾;
(8) 將離心管從離心機中取出,用酒精噴灑後拿進超淨台;
(9) 棄掉離心管中上清,加入預冷的凍存液,吹打混勻;
(10) 將混勻的細胞加入凍存管中;
(11)將凍存管放入凍存盒中,蕞後放入-80°冰箱;
(12) 第二天把細胞轉移至液氮;

3、懸浮細胞凍存流程:
(1) 先將裝有細胞的搖瓶從培養箱拿出,用酒精噴灑瓶身後將搖瓶拿進超淨台;
(2) 打開搖瓶瓶蓋,取適量細胞放入50 ml離心管或15 ml離心管中;
(3) 將離心管配平,放入離心機中1000 rmp5分鍾;
(4) 將離心管從離心機中取出,用酒精噴灑後拿進超淨台;
(5) 棄掉離心管中上清,加入提前預冷的凍存液,吹打混勻;
(6) 將混勻的細胞加入凍存管中;
(7) 將凍存管放入凍存盒中,蕞後放入-80°冰箱;
(8) 第二天把細胞轉移至液氮;

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