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點擊次數:34 發布時間:2021-05-13

一、自噬體介紹
自噬(Autophagy),或稱自體吞噬,是一個涉及到細胞自身結構通過溶酶體機製而被分解的過程,該過程是一個受到緊密調控的步驟,幫助細胞產物在合成、降解以及接下來的循環中保持一個平衡狀態。細胞接受自噬誘導信號後,在胞漿的某處形成一個扁平的類似“脂質體”樣的膜結構,稱為Phagophore。隨著Phagophore不斷延伸,將胞漿中的細胞器等成分,全部包裹住成為密閉的結構,稱為“自噬體(autophagosome)”。自噬體形成後,可與溶酶體融合,自噬體中的內容物隨即被降解,產物(氨基酸、脂肪酸等)被輸送到胞漿中,供細胞重新利用,而殘渣或被排出細胞外或滯留在胞漿中。自噬信號通路:


 二、自噬研究策略和方法
正常細胞基礎水平自噬活性比較低,對自噬研究通常需要進行人工調節和幹預,常用藥物有:
1、自噬誘導劑
a) Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin :模擬內質網應激;
b) Carbamazepine/ L-690,330/ Lithium Chloride(氯化鋰):IMPase 抑製劑(即Inositol monophosphatase,肌醇單磷酸酶);
c) Earle's平衡鹽溶液:製造饑餓;
d) N-Acetyl-D-sphingosine(C2-ceramide):Class I PI3K Pathway抑製劑;
e) Rapamycin:mTOR抑製劑;
f) Xestospongin B/C:IP3R阻滯劑。
2、自噬抑製劑
a) 自噬抑製劑3-Methyladenine(3-MA):(Class III PI3K) hVps34 抑製劑;
b) Bafilomycin A1:質子泵抑製劑;
c) 溶酶體抑製劑Hydroxychloroquine(羥氯喹)。


3、自噬檢測
1) 透射電鏡;
電鏡作為自噬檢測的金指標。由於自噬體屬於亞細胞結構,普通光鏡下觀察不到自噬體的形成,因此,直接觀察自噬體需在透射電鏡下。Phagophore的特征為:新月狀或杯狀,雙層或多層膜,有包繞胞漿成分的趨勢。自噬體(AV1)的特征為:雙層或多層膜的液泡狀結構,內含胞漿成分,如線粒體、內質網、核糖體等。自噬溶酶體(AV2)的特征為:單層膜,胞漿成分已降解。
2) WB檢測標誌物LC3/Atg8、p62/SQSTM1、Lamps、Atg5、Atg14和Beclin-1;
a)利用Western Blot檢測LC3-II/I比值的變化以評價自噬形成。自噬形成時,胞漿型LC3(即LC3-I)會酶解掉一小段多肽,轉變為(自噬體)膜型(即LC3-II),因此,LC3-II/I比值的大小可估計自噬水平的高低。
b)利用Western Blot檢測p62蛋白來評價自噬以及自噬流的強弱:p62蛋白水平的多少與自噬流的強弱有著反比例關係。
3) 組織蛋白酶Cathepsin活力檢測;
4) IF檢測自噬潮autophagic flux。


三、自噬研究常規思路
通常情況下,除了研究自噬現象本身,大家更多的是將自噬與各種生命活動或者疾病結合起來,把自噬作為這些方向的一個機製來研究。比如研究自噬如何參與腫瘤的發生發展、如何參與腫瘤的耐藥性與複發轉移、如何參與腫瘤免疫治療的效果、如何參與炎症反應、如何參與氧化應激,如何參與自閉症、阿爾茲海默症的發生與治療等,通常的研究模式:
1)證明自噬參與了相關研究表型(電鏡、LC3II/I-WB、LC3亞細胞定位、LC3熒光示蹤監測自噬流等)
2)證明自噬在表型中起到關鍵作用(通過自噬抑製劑、激動劑進行關聯研究)
3)找到表型與自噬橋梁分子(檢測pI3K通路、Beclin-1、ATG家族各成員)
4)在基因層麵通過gain of/lost of function研究橋梁分子在自噬中的作用。
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四、自噬相關研究領域
1)自噬起始和終止的分子機製
2)細胞自噬與腫瘤
3)細胞自噬與免疫
4)自噬參與炎症信號通路的調節
5)細胞自噬與神經退行性疾病
6)激活自噬促進免疫化療和放療
7)表觀遺傳學與細胞自噬的關係
8)藥物治療自噬

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